引言： 肿瘤异质性对现有宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌（CESC）预后模型的准确性构成了挑战。目前，校正肿瘤异质性的预后模型尚未见报道。
方法： 基于GSE5787数据集（包含11例CESC患者的33个多区域样本），我们计算了患者间异质性（IPH）和肿瘤内异质性（ITH）评分。筛选低异质性基因，利用癌症基因组图谱（TCGA）的CESC队列构建预后模型。在HeLa和SiHa细胞系中验证关键基因的表达。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）增殖实验、划痕愈合迁移实验和Transwell实验评估基因敲除的功能效应。
结果： 低异质性基因主要富集于能量代谢通路，而高异质性基因则富集于免疫相关信号通路。基于X连锁Armadillo重复序列蛋白1（ARMCX1）和信号转导接头蛋白家族成员2（STAP2）构建的风险评分在预测1年、3年和5年总生存期方面，曲线下面积（AUC）分别为0.74、0.68和0.74。重要的是，该特征表现出稳健的性能，风险分类不一致率仅为18%，优于此前发表的10个CESC预后模型。整合风险评分与临床分期的列线图显示出更高的预后准确性。尽管高危组患者免疫治疗效果降低，但药物敏感性筛选鉴定出七种潜在有效的替代治疗药物。体外实验表明，敲低STAP2可抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
结论： 本研究通过ITH校正建立了一个稳健的基因特征，有望减轻单区域采样偏倚，并为CESC的预后分层提供有前景的工具。
关键词： 生物标志物，宫颈癌，免疫微环境，预后模型，肿瘤异质性
三、结果描述本研究联合使用箱线图和散点图对 MATH 分布进行可视化，并采用 Wilcoxon 秩和检验结合 Benjamini-Hochberg 校正分析各临床病理亚组间 MATH 的差异（Figure S1A）。结果显示，在年龄亚组中，高龄患者（>65 岁）的 MATH 评分显著更高（P = 0.038），提示衰老可能是促进肿瘤亚克隆积累的重要因素。按肿瘤分期分析，II 期患者的 MATH 评分显著高于 I 期患者（P < 0.05），与肿瘤进展过程中基因组异质性升高的总体趋势一致。值得注意的是，其他分期亚组之间未观察到显著差异（P > 0.05）。同样，按治疗状态（未治疗 vs. 已治疗，P = 0.135）、治疗方案（药物治疗 vs. 放射治疗，P = 0.296）或病理类型分层时，MATH 评分均未显示出统计学显著差异。
Kaplan-Meier 生存分析用于评估并比较高 MATH 评分组与低 MATH 评分组之间的总生存差异（Figure S1B）。生存曲线显示两组结局无显著区别（Log-rank P = 0.80），表明 MATH 评分对患者预后的预测价值有限。
对 11 例 CESC 患者 33 个多区域组织样本中 1500 个变异最大的基因进行无监督层次聚类，结果显示存在显著的 IPH，同一肿瘤的不同区域始终聚类在一起（Figure 1A）。进一步的 CIBERSORT-abs 分析（针对 22 种免疫细胞类型）表明免疫微环境存在明显的空间差异（Figure 1B）。Hallmark 通路热图清晰展示了肿瘤区域间免疫通路活性状态的波动，不同区域中 10 条核心通路的激活或抑制水平不一致（Figure 1C）。在肿瘤-免疫周期的关键步骤中也观察到类似差异，提示肿瘤内部免疫应答阶段的执行存在空间失调（Figure 1D）。综上所述，这些发现揭示了肿瘤微环境复杂的空间异质性特征。
Figure 1
Figure 2A 展示了 ITVS 的分布模式。15.7% 的基因观察到极端值（ITVS = 1）。通过建立 IHS（ITVS 与 CCS 的几何平均数）并对蛋白编码基因进行分组，仅有 5%（806 个基因）被归入低异质性组（Figure 2B）。低异质性组与极高异质性组前 20 个基因的热图（Figure 2C）呈现出鲜明对比：低异质性基因在各区域表达稳定，而极高异质性基因表现出显著的瘤内空间变异性。
Figure 2
功能富集分析（Figure 2D）显示，极高异质性基因与免疫相关通路密切相关，提示其在肿瘤微环境重编程中发挥作用；而低异质性基因则与能量代谢相关（Figure 2E），反映了其在核心细胞过程中的保守功能。这种表达策略的分化揭示了 CESC 的生存策略：通过稳定的代谢基因表达维持基础细胞功能，同时在免疫相关通路中保留异质性以增强适应性。
利用 TCGA 数据库的转录组数据对 CESC 与正常宫颈组织的基因表达谱进行比较（Figure 3A）。在筛选标准（|log₂FC| > 1.5，FDR < 0.05）下，共鉴定出 575 个显著差异表达基因（DEGs）。采用热图展示了最显著的 20 个 DEGs（Figure 3B）。基因本体论（GO）富集分析（Figure 3C）显示这些基因与细胞增殖相关，如染色体区域功能。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析（Figure 3D）提示细胞周期相关基因及 ECM-受体相互作用通路富集，后者可能介导肿瘤的侵袭潜能。
Figure 3
对 65 个低异质性预后基因与 575 个 DEGs 进行韦恩图分析，确定 ARMCX1 和 STAP2 为两个核心预后因素（Figure 4A）。采用 Cox 算法评估基因重要性，分别赋予 ARMCX1 和 STAP2 权重评分 0.235 和 −0.501（Figure 4B、C）。构建了风险预测模型：风险评分 = (0.235 × ARMCX1 表达量) + (−0.501 × STAP2 表达量)。在 TCGA-CESC 训练队列中（Figure 4D），高风险 CESC 患者的总生存期显著短于低风险组，该趋势在 TCGA-CESC 验证队列中得到验证（Figure 4E）。时间依赖性 ROC 曲线分析（Figure 4F、G）显示，该模型在训练队列（1 年 AUC = 0.74，3 年 AUC = 0.68，5 年 AUC = 0.74）和 TCGA 验证集（1 年、3 年、5 年 AUC 分别为 0.60、0.70、0.72）中均具有稳健的预测性能。
Figure 4
对 TCGA 训练队列中 CESC 患者数据的分析显示，风险评分亚组之间在年龄、分期、治疗史（放疗或化疗）或组织学类型方面均无统计学显著差异（Figure 4H）。该发现提示，本风险模型的预测效能独立于基线人口学特征和常规临床特征。
研究进一步评估了风险评分、年龄、肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期及组织学类型的预后预测能力。单因素 Cox 回归分析（Figure 4I）显示，总生存期与风险评分（风险比（HR）= 2.715，95% CI：1.551–4.754）和临床分期（HR = 1.403，95% CI：1.054–1.867）均显著相关。重要的是，在多因素 Cox 模型（Figure 4J）中，风险评分和临床分期均保留了独立预后价值，提示二者具有协同预测作用。基于此，研究构建了整合风险评分与临床分期的列线图（Figure 4K）。该可视化工具量化了各变量的贡献权重，使临床医生能够快速计算 1 年、3 年和 5 年总生存概率。模型验证表明其性能稳健，C 指数（Figure 4L）在 1 至 5 年随访期间始终超过 0.65，确认了随时间推移的稳定预测准确性。时间依赖性校准曲线（Figure 4M）进一步验证了模型的精确性，显示在 1 年、3 年和 5 年时预测生存率与实际观察生存率高度一致。
本预后模型在 CESC 患者风险预测中表现出稳定的性能。最重要的是，该模型有效缓解了肿瘤转录组异质性的影响。基于单区域采样构建的传统模型一致性较低，介于 27% 至 46% 之间，表明 ITH 校正能够显著降低由采样部位导致的分类偏倚。使用本新型模型时，仅 18% 的 CESC 患者获得了不一致的风险分类。该比例低于既往报道的 10 种 CESC 预测模型（Figure 5A–C）。
Figure 5
本研究整合了 149 例 TCGA-CESC 训练样本（高风险 75 例，低风险 74 例）的基因组数据，分析突变模式与风险分层之间的关联。在高风险样本中（Figure 6A、B），56 例（74.67%）携带至少一处遗传改变，其中 PIK3CA（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶催化亚基 α）突变最为常见（27%），其次为 MUC16（黏蛋白 16）和 TTN（肌联蛋白），突变类型主要为错义突变。在低风险样本中（Figure 6C、D），TTN 突变率达 34%，PIK3CA 突变也相对常见（31%）。共现与互斥分析揭示了显著关联：在高风险组中，PIK3CA 与 KMT2D（赖氨酸甲基转移酶 2D）呈共现关系（P < 0.05），提示存在协同致癌通路；在低风险组中，FLG（丝聚蛋白）与 KMT2C（赖氨酸甲基转移酶 2C）亦表现出共现关系。
Figure 6
使用 ESTIMATE 算法分析显示，高风险组的基质评分显著高于低风险组，而免疫评分未见统计学差异（Figure 6E），提示高风险患者的免疫抑制状态主要源于基质成分的改变，而非免疫细胞数量的变化。进一步使用 CIBERSORT-abs 算法定量免疫浸润（Figure 6F）显示，高风险组树突状细胞浸润减少。免疫检查点表达谱分析（Figure 6G）表明，高风险组中调控因子（肿瘤坏死因子超家族成员 18（TNFSF18）、肿瘤坏死因子受体超家族成员 25（TNFRSF25））显著下调。
鉴于目前缺乏同时具备转录组与临床结局数据的公开 CESC 免疫治疗队列，研究采用 IMvigor210 尿路上皮癌队列进行间接验证，以评估本 ITH 校正特征标签是否能跨癌种预测免疫治疗反应。基于 IMvigor210 队列的验证显示，高风险组对免疫治疗表现出更强的耐药性：疾病进展（PD）和疾病稳定（SD）病例比例达到 82%，高于低风险组的 72%（Figure 6H）。此外，达到部分缓解（PR）的患者其中位风险评分显著低于 PD 病例（Figure 6I）。虽然这为该方法的普适性提供了初步证据，但研究指出仍需 CESC 特异性免疫治疗验证队列来确认其在 CESC 中的临床适用性。
鉴于高风险患者预后较差且对免疫治疗耐药，研究通过 pRRophetic 平台筛选出 7 种抗肿瘤药物（Figure 7A–G），这些药物与风险评分呈显著负相关（r < −0.03），且在高风险组中 IC₅₀ 值更低。这些发现提示基于风险评分的药物选择可能优化高风险患者的个体化治疗策略。
Figure 7
结合 TCGA 与基因型-组织表达（GTEx）样本分析（Figure 8A），观察到 CESC 样本中 ARMCX1 和 STAP2 存在表达失调。为验证该结果，进行了 RT-qPCR 实验（Figure 8B）。与正常宫颈 H8 细胞相比，ARMCX1 在 HeLa 和 SiHa 细胞中显著下调；值得注意的是，STAP2 在两种恶性细胞系中均显著上调。
Figure 8
利用基于网络的平台进行单细胞和空间转录组分析。单细胞测序解析出 7 个功能定义的细胞亚群（Figure 8C），其中成纤维细胞亚群显示出 ARMCX1 的显著富集（Figure 8D、E）。此外，STAP2 主要在恶性细胞中表达（Figure 8D、E）。对代表性 CESC 样本的空间转录组分析将含有恶性细胞（比例 >0）的组织区域定义为恶性区域，而完全由正常细胞组成的区域定义为正常区域。ARMCX1（Figure 8F）在非恶性区域表达显著更高，而 STAP2（Figure 8G）则特异性富集于肿瘤恶性区域。
PCR 证实 STAP2 siRNA1 和 siRNA2 可降低 HeLa 细胞中 STAP2 的 RNA 表达（Figure 9A）。CCK-8 实验显示 STAP2 敲低显著抑制细胞增殖（Figure 9B，p < 0.05）。划痕愈合实验表明细胞迁移能力受损（Figure 9C–F）。Transwell 迁移实验（Figure 9G）显示 STAP2 沉默后迁移细胞数较对照组减少。Matrigel 侵袭实验（Figure 9H）进一步显示细胞侵袭能力下降。这些发现表明 STAP2 敲低可显著抑制 HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭。
Figure 9
四、此文总结本研究针对肿瘤内异质性（ITH）对宫颈癌（CESC）预后评估的干扰，基于GSE5787多区域测序数据系统量化了患者间异质性与肿瘤内异质性，筛选出表达稳定但具有预后价值的低异质性基因，进而构建了基于ARMCX1与STAP2的双基因预后特征。该模型在TCGA队列中预测1年、3年、5年总生存的AUC分别为0.74、0.68和0.74，风险分类不一致率仅18%，稳定性优于10种已发表的CESC预后模型；结合临床分期构建的整合列线图进一步提升了预后判断准确度。功能层面，低异质性基因主要富集于能量代谢通路，而高异质性基因则与免疫信号相关。研究还发现，高风险组患者免疫治疗获益可能受限，但通过药物敏感性分析筛选出7种潜在有效药物作为替代方向；体外实验证实，STAP2敲低可抑制HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭能力。该ITH校正模型有望减轻单区域取样偏倚，为宫颈癌的精准预后分层和个体化治疗决策提供可靠工具。
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